Система контроля показателей микробиологической безопасности молока и молочной продукции

Г. М. Свириденко, д. т. н., М.Б. Захаров, к. т. н., Н.Н. Оносовская,

ВНИИМС — филиал ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН, г. Углич

Основным требованием, предъявляемым к молоку и молочной продукции, является обязательное соответствие нормам безопасности, установленным ТР ТС 021/2011"О безопасности пищевой продукции"и ТР ТС 033/2013 «О безопасности молока и молочной продукции», при этом показатели микробиологической безопасности являются определяющими.

Указанные правовые акты регламентируют допустимые уровни содержания следующих групп микроорганизмов:

• санитарно-показательных микроорганизмов: мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы (КМАФАнМ), бактерии группы кишечных палочек (БГКП);
• микроорганизмов порчи (дрожжи и плесневые грибы);
• заквасочной микрофлоры и пробиотических культур;
• условно-патогенных микроорганизмов (Staphylococcus aureus);
• патогенных микроорганизмов, в том числе бактерий рода Salmonella и Listeria monocytogenes.

В молочных продуктах для детского питания дополнительно нормированы бактерии E. coli.

В сыром молоке, кроме допустимых уровней содержания микроорганизмов, установлена допустимая норма содержания соматических клеток как показателя безопасности, косвенно определяющего риски, связанные с наличием мастита.

Для реализации системы микробиологического контроля показателей безопасности кроме перечня значимых микроорганизмов и допустимых норм их содержания необходимо обладать комплексом методов и средств контроля, а также проводить контроль с эффективной периодичностью.

Организация надежного микробиологического контроля предполагает разработку комплекса стандартизованных методов, реализуемых с помощью определенных средств контроля.

В настоящее время методы контроля всего перечня показателей микробиологической безопасности регламентированы соответствующими межгосударственными стандартами, краткое описание которых представлено ниже.

ГОСТ 32 901–2014 «Молоко и молочная продукция. Методы микробиологического анализа»

Стандарт регламентирует методы микробиологического анализа как групп микроорганизмов, нормируемых ТР ТС 033/2013, так и значимых микроорганизмов порчи, подлежащих контролю в условиях производственных лабораторий на молочных предприятиях. Методы микробиологического контроля, включенные в стандарт, максимально возможно актуализированы с методами микробиологического контроля молока и молочной продукции стандартов ISO.

Методы контроля, включенные в стандарт, регламентируют порядок и процедуру подтверждения микробиологической безопасности сырого молока и продуктов его переработки.

Одним из основных показателей безопасности молока и молочных продуктов, который с определенной достоверностью говорит об общей бактериальной обсемененности (исключение составляют облигатно анаэробные бактерии), является показатель КМАФАнМ.

Контролю КМАФАнМ в условиях производственных лабораторий подлежит при входном контроле сырое молоко и другие виды сырья; производственная среда (смывы с оборудования, вода и воздух); при выходном контроле — молочные продукты, произведенные без использования заквасочных микроорганизмов (молоко, масло, плавленый сыр и т. д.).

Согласно положениям ГОСТ 32 901–2014,метод определения КМАФАнМ основан на подсчете колоний, вырастающих на твердой питательной среде КМАФАнМ при температуре (30 ±1) °С в течение 72 ч. В соответствии с действующей системой нормирования показатель КМАФАнМ выражается в колониеобразующих единицах (КОЕ/г, см³), что предполагает подсчет всех видимых колоний, выросших на чашках трех последовательных разведений, выбранных исходя из возможной обсемененности конкретного продукта. Подсчету подлежат чашки, содержащие от 15 до 300 колоний. Количество микроорганизмов вычисляют как среднее арифметическое или средневзвешенное значение.

Основным показателем, отражающим уровень санитарии и гигиены при получении молочных продуктов и косвенно свидетельствующим об их безопасности и качестве, является контроль на наличие БГКП.

Контроль по показателю БГКП в условиях производственных лабораторий проводят при входном контроле сырья (кроме сырого молока); для оценки санитарно-гигиенических условий производства молочной продукции (смывы с оборудования, вода, смывы с рук и одежды персонала); при проверке эффективности пастеризации молока; при выходном контроле всех молочных продуктов, за исключением стерилизованных и ультрапастеризованных с асептическим розливом. В соответствии с системой нормирования, принятой в РФ и странах Таможенного союза, рассматриваемый показатель выражается в отсутствии БГКП в определенном объеме или массе продукта.

Основной метод определения БГКП в соответствии с ГОСТ 32 901–2014 предполагает проведение посевов продукта или его разведений в жидкую средуКесслер, углеводным компонентом которой является лактоза при обязательном отсутствии глюкозы. Метод определения БГКП по признакам роста на среде Кесслер основан на способности БГКП сбраживать в питательной среде лактозу с образованием газа и кислоты при температуре (37 ±1) °Св течение 24 ч. При этом признаком роста БГКП является визуально наблюдаемое накопление газа в поплавке.

В соответствии со стандартами ISO контроль БГКП в молочных продуктах проводится на плотных питательных средах и выражается количественно в КОЕ/г (см³). Аналогом европейской селективной среды VRBL — агара для выделения и подсчета БГКП является плотная питательная среда Агар желчный фиолетово-красный (АЖФК).

Определение количества БГКП на плотной питательной среде АЖФК основано на способности БГКП давать рост и образовывать типичные колонии при температуре (37 ±1) °Св течение 24 ч. Развитие БГКП на среде АЖФК сопровождается образованием поверхностных розовато-фиолетовых сочных колоний диаметром более 0,5 мм и глубинных мелких колоний в форме «лодочек» темно-красного цвета. Метод с использованием среды АЖФК позволяет проводить определение количества БГКП в молоке и молочной продукции. В случае поставки молочных продуктов на экспорт необходимо получать результаты по показателю БГКП в КОЕ и пользоваться именно этим методом.

Впервые на уровне межгосударственного документа стандартизованы методы определения технически вредных микроорганизмов (микроорганизмов порчи) молока и продуктов переработки молока: общего количества психротрофных, термофильных и спор аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. Методы определения данных групп бактерий предусматривают использование среды КМАФАнМ с изменением условий культивирования:

• термофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы определяют после выдержки посевов при температуре (44 ±1) °С в течение 72 ч;
• психротрофные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы выявляют при термостатировании посевов при (7 ±1) С с выдержкой 7−10 суток;
• количество спор аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов определяют при посеве предварительно прогретого при температуре (88 ±2) °С в течение (12 ±2) мин посевного материала и последующем культивировании при (30 ±1) °С в течение 72 ч.

В молочной промышленности с целью изучения морфологических особенностей микрофлоры молока, лабораторных и производственных заквасок, молочной продукции проводят микроскопические исследования. Правила проведения испытаний установлены ГОСТ 32 901–2014, включающим описание порядка проведения микроскопических исследований с использованием различных способов окрашивания микропрепаратов.

В качестве экспресс-методов контроля сырого молока в стандарте описан метод контроля общей бактериальной обсемененности по редуктазной пробе, позволяющий оценить уровень бактериальной обсемененности сырого молока на границе до или более 5·10⁵ клеток/см³, что соответствует требованиям ТР ТС 033/2013 при приемке сырого молока. Использование данного метода дает возможность в течение одного часа оценить поступившее молоко и принять решение о его приемке.

Для определения сыропригодных свойств молока необходимо определить его способность к сычужному свертыванию. С этой целью разработан и включен в стандарт экспресс-метод оценки способности молока, подвергнутого температурной обработке (пастеризации), к сычужному свертыванию -сычужная проба. Данный метод позволяет в течение часа определитьсыропригодность молока по характеру образовавшегося сгустка.

ГОСТ 33 566–2015"Молоко и молочная продукция. Определение дрожжей и плесневых грибов"

Дрожжи и плесневые грибы в большинстве случаев рассматриваются как микрофлора порчи молочной продукции, вызывающая органолептические пороки, пороки внешнего вида и консистенции, что приводит к снижению качества и хранимоспособности молочных продуктов. В соответствии с ТР ТС 033/213 допустимый уровень их содержания в ряде молочных продуктов колеблется от 50 до 200 КОЕ/г (см³).При выходном контроле определение дрожжей и плесневых грибов проводят в термически обработанных молочных продуктах с длительным сроком хранения, кисломолочных продуктах без внесения дрожжей в качестве заквасочной микрофлоры со сроками годности более 72 ч, кисломолочных продуктах, производимых с использованием дрожжей.

При изготовлении таких кисломолочных продуктов, как кефир, айран, кумыс, дрожжи являются необходимым элементом заквасочной микрофлоры, а их содержание в продукте нормировано в соответствии с ТР ТС 033/2013 на уровне не менее 10⁴ -10⁵ КОЕ/см³.

В условиях производственных лабораторий определение дрожжей и плесневых грибов проводят не только при контроле готовой продукции, но и при необходимости выявления причин появления соответствующих пороков. Так, дополнительному входному контролю подвергается сырое молоко при определении показателей сыропригодности, некоторые виды вспомогательного сырья (различные фруктовые наполнители), упаковочные материалы и объекты производственной среды (смывы с деревянного оборудования, воздух).

Согласно положениям ГОСТ 33 566–2015метод определения основан на способности дрожжей и плесневых грибов, содержащихся в молоке и молочной продукции, независимо от их видовой и групповой принадлежности при посеве продукта либо его разведений на плотную питательную среду образовывать видимые характерные колонии через 3−5 суток при температуре 25 ºС или 30 ºС. В соответствии с действующей системой нормирования показатель количества дрожжей и плесневых грибов выражается в колониеобразующих единицах — КОЕ/г (см³). Подсчету подлежат чашки, содержащие от 5 до 150 колоний дрожжей и от 5 до 50 колоний плесневых грибов. Количество микроорганизмов вычисляют как среднеарифметическое или средневзвешенное значение.

В соответствии с ГОСТ 33 566–2015для определения дрожжей и плесневых грибов используютСреду агаровую для определения дрожжей и плесневых грибов и среду Сабуро.

Для повышения селективности питательных сред стандарт предполагает использование антибиотиков с целью подавления развития бактерий и беспрепятственного развития дрожжей и плесневых грибов. В документе определены требования к используемым антибиотикам. Использование Среды агаровой для определения дрожжей и плесневых грибов возможно как с добавлением, так и без добавления антибиотиков, а для среды Сабуро внесение антибиотиков при определении дрожжей и плесневых грибов является обязательным.

Разработанный ранее специалистами ВНИИМС ГОСТ 32 012–2012«Молоко и молочная продукция. Методы определения содержания спор мезофильных анаэробных микроорганизмов» предназначен для определения значимой группы технически вредных микроорганизмов. Стандарт устанавливает метод определения содержания общего количества спор мезофильных анаэробных микроорганизмов (бактерий) и метод определения спор мезофильных лактатсбраживающих анаэробных микроорганизмов (бактерий) в сыром и подвергнутом термизации или низкотемпературной пастеризации молоке и другой молочной продукции.

В условиях производственных лабораторий определение содержания спор анаэробных микроорганизмов проводят при входном контроле сырья для выработки созревающих и плавленых сыров (сырое молоко, сухое молоко, различные молочные продукты, используемые при производстве плавленых сыров).

В соответствии с ГОСТ 32 012–2012определение содержания спор мезофильных анаэробных микроорганизмов проводится путем посева продукта или его разведений в питательные среды СДА и ЛАССА, термостатирования посевов при (37 ±1) °С и подсчета наиболее вероятного числа спор (НВЧ). Для выявления спор посевной материал прогревают при температуре (75 ±1) °С в течение 30 мин с целью уничтожения вегетативных форм микроорганизмов. Для получения количественной характеристики каждое из выбранных разведений засевают в две пробирки с рабочей питательной средой. Оценку развития споровых микроорганизмов в питательной среде проводят по изменению цвета среды с красного на желтый (СДА), с малиново-красного на соломенно-желтый (ЛАССА) и газообразованию (появлению разрывов агарового столбика).

В стандарте оговорены условия при выполнении посевов для обеспечения роста анаэробных микроорганизмов: прогрев питательных сред перед посевом для удаления растворенного в них кислорода; посев в высокий столбик рабочей питательной среды или культивирование посевов в анаэростатах; заливка столбика среды после посева стерильным вазелиновым маслом или водным агаром для уменьшения диффузии кислорода из воздуха и создания анаэробных условий.

Содержание споровых анаэробных микроорганизмов как показателя микробиологической безопасности не нормировано ТР ТС 033/2013. Однако этот показатель важен для оценки молока при производстве сыров — в соответствии с СТО ВНИИМС 019−2019 «Молоко коровье сырое. Технические условия"количество спор мезофильных анаэробных лактатсбраживающих маслянокислых микроорганизмов в молоке должно быть при выработке сыров с пропионовокислыми бактериями не более 2500 НВЧ/дм³; при производстве прочих созревающих сыров -не более 13 000 НВЧ/дм³.

Основным идентификационным показателем для молочнокислых продуктов является содержание заквасочной микрофлоры, для контроля которой разработан ГОСТ 33 951–2016 «Молоко и молочная продукция. Методы определения молочнокислых микроорганизмов».ГОСТ 33 951−2016 распространяется на молоко и молочную продукцию и устанавливает методы определения молочнокислых бактерий, в том числе метод посева разведений продукта на/в твердые питательные среды. В соответствии с действующей системой нормирования количество молочнокислых микроорганизмов выражается в колониеобразующих единицах — КОЕ/г (см³). Подсчету подлежат чашки, содержащие от 15 до 150 колоний. Количество молочнокислых микроорганизмов вычисляют как средневзвешенное значение, т. е. посевы необходимо вести в два ряда.

Стандарт предусматривает использование ряда питательных сред, в том числе среду для определения количества лактококков и термофильных стрептококков (МКМ-1) и среду для определения количества молочнокислых палочек (МКМ-2).

Чашки с посевами инкубируют в течение 72 ч:

• при температуре (30 ±1) °С для подсчета мезофильных молочнокислых бактерий;
• температуре (37 ±1) °С для подсчета термофильных молочнокислых бактерий;
• температуре (37 ±1) °С для совместного подсчета мезофильных и термофильных молочнокислых бактерий.

При определении количества L. bulgaricus и St. thermophilus в образцах йогурта чашки с посевами для подсчета L. bulgaricus термостатируют при температуре (37 ±1) °С в течение 72 ч в анаэробных условиях, а St. thermophilus — при температуре (37 ±1) °С в течение 48 ч.

При определении L. casei или L. rhamnosus чашки с посевами термостатируют при температуре (30 ±1) °С в течение (72 ±3) ч.

В условиях производственных лабораторий молочнокислые микроорганизмы подлежат определению при выходном контроле готовой продукции, полученной с использованием заквасочных культур, уровень которых нормирован в соответствии с ТР ТС 033/2013для продуктов кисломолочных и сметаны — не менее 1·10⁷ КОЕ/см³ (г); для творога и кисломолочного мороженого — не менее 1·10⁶ КОЕ/г.

В настоящее время молочные продукты, полученные с использованием пробиотических заквасочных культур, завоевали особое место среди функциональных молочных продуктов. Для обеспечения профилактического и диетического действия функциональных молочных продуктов необходим контроль содержания молочнокислых и пробиотических микроорганизмов в готовой продукции. С целью определения бифидобактерий разработан ГОСТ 33 924–2016"Молоко и молочная продукция. Методы определения бифидобактерий".

Стандарт распространяется на молочную продукцию и устанавливает метод селективного подсчета бифидобактерий. Особенностью данного метода является использование техники посева в высокий столбик среды для создания анаэробных условий и применение антибиотиков для выявления бифидобактерий в смешанной с молочнокислыми бактериями культуре. Культивирование проводят при температуре 37 °C в течение 5 суток. В ГОСТ 33 924–2016 включены методы посева в плотные и полужидкие питательные среды.

При посеве испытуемых образцов в питательную среду для определения бифидобактерий ОББ ведут подсчет колоний в виде дисков и гречишных зерен, характерных для бифидобактерий. В соответствии с действующей системой нормирования показатель количества бифидобактерий выражается в колониеобразующих единицах — КОЕ/г (см³).

В условиях производственных лабораторий контроль бифидобактерий проводят при выходном контроле кисломолочных продуктов, содержащих бифидобактерии. В соответствии с ТР ТС 033/2013 содержание пробиотической микрофлоры в продуктах должно составлять не менее 1·10⁶ КОЕ/см³ (г).

Условно-патогенные и патогенные микроорганизмы в молоке и молочных продуктах контролируют на предмет их патогенности в микробиологических лабораториях, расположенных вне производств и лицензированных на данный вид деятельности в соответствии следующими документами:

• ГОСТ 30 347–2016"Молоко и молочная продукция. Методы определения Staphylococcus aureus";
• ГОСТ 31 659–2012 (iso 6579:2002) «Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella»;
• ГОСТ 32 031–2012 «Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes».

Однако что касается возможности выявления патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в молоке и молочных продуктах и определения степени риска от наличия опасных бактерий в нормируемом количестве исследуемого образца, в условиях производственных лабораторий можно проводить предварительную оценку уровня безопасности.

Так, в соответствии с ГОСТ 32 901–2014 регламентирован метод дифференциации энтеробактерий по виду образуемых колоний на среде Эндо. При этом на среду Эндо высевают не сам продукт, а делают высев из посевов нормируемого разведения продукта на накопительных средах с признаками развития БГКП. Количественный подсчет микроорганизмов не проводят.

Метод дифференцированного определения энтеробактерий основан на способности ферментирующих лактозу микроорганизмов (лактозоположительные БГКП) образовывать на среде Эндо темно-красные колонии с характерным металлическим блеском вследствие взаимодействия образующихся альдегидов с фуксином в присутствии сульфита натрия при температуре (37 ±1) °С в течение 24 ч. Образование полупрозрачных бесцветных или бледно-розовых колоний свидетельствует о принадлежности микроорганизмов, давших рост на накопительных питательных средах, к лактозоотрицательным патогенным энтеробактериям, в том числе рода Salmonella. При получении на среде Эндо роста сомнительных колоний продукт передается в специализированные лаборатории для подтверждения наличия в образце патогенных энтеробактерий.

Для контроля продукции в условиях производственных лабораторий на предмет наличия стафилококков можно делать посевы нормируемых разведений на молочно-солевой агар в соответствии с ГОСТ 33 568–2015 «Молоко и молочная продукция. Методы определения солеустойчивых микроорганизмов».

Метод основан на способности солеустойчивых микроорганизмов, содержащихся в молоке и молочной продукции, независимо от их видовой и групповой принадлежности образовывать видимые колонии при посеве продукта либо его разведений на плотную питательную среду, содержащую 7,5% хлористого натрия.

Посевы культивируют при температуре (37 ±1) °С в течение 48−72 ч и проводят визуальный анализ выросших колоний. На молочно-солевом агаре дают рост солеустойчивые микроорганизмы, в том числе стафилококки, микрококки, споровые аэробные палочки, возможен рост энтерококков и солеустойчивых молочнокислых микроорганизмов. Однако колонии стафилококков имеют характерный вид — это поверхностные, круглые, среднего размера, блестящие, непрозрачные, непигментированные или пигментированные (золотисто-желтые, белые) колонии с ровным краем. Для подтверждения принадлежности выросших колоний к стафилококкам их проверяют на каталазоположительность и микроскопируют. Каталазоположительные кокки, располагающиеся в характерных скоплениях в виде виноградных гроздей, дают возможность говорить о наличии стафилококков в нормированном разведении продукта.

Однако для отнесения их к Staphylococcus aureus необходим дальнейший контроль в специализированной лаборатории вне производства.

При входном контроле сырого молока необходимо определять такой важнейший показатель безопасности, как количество соматических клеток, нормируемый ТР ТС 033/2013.Методы контроля сырого молока по содержанию соматических клеток установлены ГОСТ 23 453–2014 «Молоко сырое. Методы определения соматических клеток».

Стандарт распространяется на сырое молоко и устанавливает методы определения количества соматических клеток по изменению вязкости визуальным способом и с использованием вискозиметра, метод определения соматических клеток флуоресцентной микроскопией и прямой метод определения соматических клеток путем микроскопирования.

Выпуск безопасной и качественной молочной продукции предусматривает отсутствие в ней загрязнителей химической и биологической природы, в том числе ингибирующих веществ, которые независимо от их природы тормозят или препятствуют развитию микроорганизмов. Спектр веществ, наличие которых в молоке может быть причиной ингибирования микроорганизмов, крайне разнообразен по природе, химическому составу и порогу ингибирования.

Для решения задачи контроля наличия или отсутствия ингибирующих веществ в молоке с целью дальнейшего получения качественной и безопасной молочной продукции разработан ГОСТ 23 454–2016 «Молоко. Методы определения ингибирующих веществ». Стандарт распространяется на сырое молоко цельное и обезжиренное, термически обработанное, предварительно восстановленное из сгущенного, концентрированного или сухого молока и устанавливает методы определения ингибирующих веществ: антибиотиков; дезинфектантов на основе хлора, перекиси водорода и надуксусной кислоты; поверхностно-активных веществ; фальсифицирующих веществ, добавляемых в молоко для ограничения развития микрофлоры, в том числе перекиси водорода и формалина.

Применение в практике контроля молока методик определения согласно ГОСТ 23 454–2016 позволит повысить гарантию безопасности выпускаемой молочной продукции и снизить риски нарушения молочнокислого процесса при выработке ферментированной молочной продукции с использованием заквасочной микрофлоры.

Для контроля антибиотиков, которые являются частью системы ингибирования, разработан целый комплекс стандартов на методы контроля их остаточного количества в сырье и пищевых продуктах, в том числе молочных.

В настоящее время наиболее востребованными и адаптированными к контролю молока и молочной продукции на предмет выявления антибиотиков четырех нормируемых групп являются стандарты, разработанные специалистами ВНИМИ, — ГОСТ 32 219–2013 «Молоко и молочные продукты. Иммунологические методы определения наличия антибиотиков»и ГОСТ 33 526−2015 «Молоко и продукты переработки молока. Методика определения содержания антибиотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии».

Таким образом, в настоящее время производители молочной продукции владеют полным комплексом нормативных документов для обеспечения системы контроля показателей микробиологической безопасности молока и молочной продукции и соответствующими методами и средствами контроля.

comments powered by HyperComments